Gru si penjahat menyusun rencana untuk mencuri bulan dari langit. Namun ia kesulitan melakukan tugasnya setelah harus merawat tiga anak yatim piatu.
Penjaga malam museum yang malang, Larry Daley, harus mencari nafkah dengan menghidupi teman-teman pameran karena mereka sudah dipindahkan ke arsip di Smithsonian Institution. Petualangan (salah) Larry kali ini antara lain pertemuan dekat dengan Amelia Earhart, Abe Lincoln, dan Ivan the Terrible.
Alvin, Simon, dan Theodore datang kembali, bersama dengan manajer mereka yang kerepotan, Dave. Namun, kali ini mereka punya saingan: Para Tupaiwati.